アプリケーション

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高解像度3D視覚化を実現した例を紹介します。
この革新的な技術は、ナノメートルスケールの3D生物学的構造の評価、前例のないアクセスを提供します。
生物学的プロセスの解明、疾患メカニズムの説明、治療戦略の進歩に不可欠で、研究者に生命科学の分野での進歩を可能にします。

材料科学においても、金属腐食、有機コーティングの影響、顔料分布、金属間化合物粒子の分散などの理解が深まります。
生命科学の進歩と同じ方法で、材料科学が次の次元に拡張されます。

【NEW】電池材料の化学分析
< 3Dエネルギー分散分光法を備えたSBF-SEM >

Oxford Instrumentsおよびオックスフォード大学材料学科との共同研究により、電池におけるSBF(Serial Block Face)-SEMイメージングの汎用性を実証しました。
単体または樹脂埋め込み型の陽極・陰極材料の高精度セクショニングを実施し、粒度分布などの3Dボリュームイメージングを構築しました。後方散乱電子コントラストとX線収集による化学同定をボリュームコンテキストで活用することで、不純物やサイクル劣化に関する知見を得る可能性は大きく広がります。
(下記▼プルダウンから詳細をご覧いただけます)

図:Oxford Instruments Unity + Ultim Max 100を用いてTESCAN SEMで撮影したNi-Mn-Co-O電池正極。
  3 x 2視野(合計140 x 71 µm)をモンタージュし、後方散乱電子シグナルとエネルギー分散型X線シグナル
Ni Kα1、O Kα1(ピンク)、C Kα1(緑)、Al Kα1(赤)を合成しました。
1サイクルあたり約2分でセクショニングとイメージングを行いました。
  ※資料提供:オックスフォード大学材料学科 Yige Sun 様
Abstract

【背景】
電池材料を徹底的に理解することは、その開発において非常に重要です。そして、多くの重要な特性は、材料の微細構造を3次元的に理解しているかどうかにかかっています。これには、多孔質電極を介したLi+拡散経路の複雑さを示す屈曲性、そして多くの場合ニッケル・マンガン・コバルト酸化物(NMC)粒子で構成される活物質の表面積と連結性などが含まれます。

一般的な体積研究では、粒子統計には低解像度のX線技術、または多くの場合1つまたは2つの孤立した粒子に限定される、時間のかかる集束イオンビーム研究が用いられています。現在では、広範囲・高解像度の体積イメージングとSBF(Serial Block Face)-SEM、特性X線を用いたエネルギー分散型X線分光法(EDS)による元素分析を組み合わせることで、サイクル後の物質拡散や劣化、粒子のひび割れ、空隙など、さまざまなプロセスを並行して研究することが可能です。

【EDS/BEX画像取得】
上図は、6枚の画像を合成モンタージュし、140 x 71 µmのフルサイズ画像を作成しました。この画像では、二次電子像とBEX(後方散乱X線像)像を同時に取得しています。Ni-Mn-Coサンプル(約1.5 x 0.7 x 1.0 mm)は、TESCAN SEMに搭載されたOxford Instruments Unity + Ultim Max 100エネルギー分散型分光計を用いて、加速電圧15.0 kV、作動距離10.0 mmで画像取得されました。

両シグナルのピクセル解像度は48nmで、ミクロトームの切片厚は100nmでした。Unity検出器の高速シグナル収集とKatanaミクロトームの効率的な自動化を組み合わせることで、モンタージュされた各画像切片を約2分で取得し、一晩で50µm以上の深度で画像化することが可能になりました。また、非同期測定も可能です。非同期測定では、EDSスペクトルを500~1000nmごとに収集し、後方散乱画像は切片ごとに収集することで、実験目的に応じて収集速度をさらに向上させることができます。
活性NMC粒子、周囲のバインダー、電解質、およびAl箔集電体は、表面積や球形度などの体積統計学的研究と、化学的な空間分布とのマッチングの両方において、明瞭に分離できました。

左図:オックスフォード大学でリチウム陽極研究のため、グローブボックス内の不活性雰囲気下でKatanaミクロトームを装着する様子。
右図:典型的な電池正極内のNMC粒子群の単一視野(34 x 25 x 7.5 µm)のクローズアップ画像。電子線シグナルと特性X線シグナルの両方が示されています。 ピクセルサイズは33 nmで、EDSの測定限界に近づいています。切片厚は50 nm。


【断面作製方法】
初期試験では、一般的なNMC(ニッケル・マンガン・コバルト酸化物)正極単体での断面作製は可能であり、システムのすべての構成部品を、Volume EM分析に十分な表面品質で、約10nmの厚さにきれいに切断できることが示されました。しかしながら、活物質粒子と周囲のバインダーマトリックス間の硬度の相対的な差により、時折粒子が引き抜かれ、空隙が発生することが見られました。これは、電池サンプル固有の空隙に関する解釈上の問題を引き起こす可能性があります。
結論として、ライフサイエンスにおけるSBF(Serial Block Face)-SEMの既存知見を活用し、バインダーと粒子の材料特性をより適切に整合させるために、電池材料を樹脂に埋め込むことにしました。Spurr樹脂は、粘度が低く、高密度マトリックスへの浸透性が高いことから選択されました。Spurr配合樹脂で8時間硬化させた陽極は、より高い均一性と信頼性で切断できることがわかりました。浸透法のさらなる開発は、電池全体の大面積切断をめざしています。

【大気感受性】
オックスフォード大学での最近の研究では、不活性雰囲気下におけるSBF-SEMワークフローの可能性が実証されました。Katanaミクロトームのコンパクトな設計により、システムはグローブボックスのロードロックから挿入でき、隣接するTESCAN Miraのステージ上に設置できるため、低酸素環境下でLi陽極を完全にサンプルマウントすることができるようになりました。

【NEW】脳汚染物質のためのCLEMワークフロー

BBSRCのバイオサイエンスパートナーシップ向け施設利用助成金を通じて、英国保健安全保障庁(UKHSA)、中央レーザー施設(CLF)、ConnectomXの共同研究により、厚い組織サンプルの効率的なボリュームイメージングを実現する革新的なワークフローが開発されました。

このワークフローでは、相関光顕微鏡、シリアルブロックフェイス(SBF(Serial Block Face)-SEM)、集束イオンビーム(FIB)顕微鏡を用いて、動物モデルにおける吸入粒子が血液脳関門(BBB)に与える影響を調査し、特に認知症関連の脳の健康への影響について調査しています。
(下記▼プルダウンから詳細をご覧いただけます)

図:CLEMパイプライン:マウス脳におけるナノ粒子曝露の影響に関する高精度なボリュームデータを取得するために、新たなワークフローが開発されました。染色前に、作製した大きな切片(約200 x 1300 x 1300 µm)を多光子顕微鏡(MPM)でプローブし、シリアルブロックフェースイメージングの効率性を利用してナノ粒子領域を特定しました。

Abstract

【背景】
大気汚染は認知症の危険因子として認識されており、修正可能な要因を通じて全症例の約40%に寄与しているとされています(Lancet Commission, 2020年)。吸入された粒子は、嗅神経または血流を介して脳に移動し、血液脳関門(BBB)を破壊し、神経炎症を引き起こす可能性があります。本プロジェクトでは、走査型電子顕微鏡を用いて、特に記憶喪失やアルツハイマー病に関連する領域である海馬における粒子の分布とBBBの完全性を調査しました。

【ワークフロー】

・動物への曝露と組織調製
動物を粒子に曝露し、脳組織を200µmの厚さに切片化します。

・標準マーキング:
二光子共焦点顕微鏡を用いて、海馬切片内のナノ粒子の侵入領域を特定します。レーザーを用いて、目的の領域 (ROI) の上部に数十µm幅の十字型の標準マーカー(「ブランディング」)を作成し、関心領域を特定することで、予想される形状プロファイルに人工的なコントラストを与えます。

・サンプル処理:
サンプルは重金属で染色され、樹脂に埋め込まれます。

・SBF(Serial Block Face)-SEMイメージング:
Katanaミクロトームを装備したZeiss Crossbeam SEMを用いて、サンプルを200nmの厚さで連続的に薄切していき、ブロック面全体(約500~1300µm²)の広視野を迅速にイメージングすることで、ブランディングの位置を特定します。同時に、光学顕微鏡画像やFIBボリュームと照合するためのコンテキスト3Dデータセットを作成します。各切片は約10秒で作成され、パラメータに応じて30~60秒で画像が取得されます。

・自動検出:
「ハフ変換」を用いて直線を検出する解析アルゴリズムが、各広視野SBF-SEM画像を解析し、ブランディングパターンを検出します。その後、Katanaミクロトームと通信し、ROIが特定されると切片作製を停止します。その後、ミクロトームは迅速にチャンバーから取り外され、サンプルはFIB-SEM用にマウントされます。

・FIB-SEMイメージング:
約20µmの視野を持つFIB-SEMを用いて、ROIの高倍率3Dイメージングを実施し、血管内皮に目に見える影響を与えるナノ粒子の侵入を捉えることに成功しました。データセットが収集されると、画像解析ソフトウェアを用いて2つのボリュームデータセットを相関させることができ、サンプルを調製して繰り返し研究に活用することができます。

図:「X」でスポットをマーク: 多光子顕微鏡により、対象ナノ粒子のシグナルから関心領域を正確に特定することができました。重金属染色により機能的な発光は失われますが、基準マークは保持されており、シリアルブロックフェイス広視野イメージング(切片厚200nm)でトラッキングされました。
  自動ブランディング検出機能により切片作製が停止し、新たに露出した関心領域をFIB-SEMで観察することができます。


【結果】
・効率の向上:
Katanaミクロトームは、SBF(Serial Block Face)-SEMによる厚い脳切片の効率的な領域特定を可能にし、FIB-SEMデータと組み合わせるコンテキストVolume EMデータセットを構築することで、相関光電子顕微鏡法 (CLEM) を改善しました。

・BBB損傷:
画像検査により、浮腫や不規則な内皮構造などのBBB破壊が明らかになり、暗い凝集体は転座した粒子を表していると考えられます。

・神経学的影響:
このワークフローにより、吸入された粒子がBBBの完全性を損ない、神経学的健康の低下につながる可能性があるという証拠が得られました。

【NEW】シロイヌナズナ「茎頂分裂組織の3D再構成」

JEOL IT700HRとKatanaを用い、細胞構造の形成や成熟過程を高解像度で可視化しました。

シロイヌナズナの茎頂分裂組織において、液胞と細胞壁を強調した3D再構成画像を取得しました。
細胞分裂の空間配置や分化プロセスを立体的に解析し、植物の成長制御メカニズムの解明に貢献します。

【NEW】マウスの小腸「陰窩」

陰窩(いんか)は、幹細胞やパネート細胞を含む様々な種類の細胞で構成されます。
陰窩は腸管絨毛の底部に位置し、絨毛を形成する吸収上皮細胞の供給源として、重要な役割を果たしています。

Katanaは、超音波振動するダイヤモンドナイフと、1nmの分解能で動作するサンプルステージを採用しております。
これによって、陰窩の観察では、セクション厚 30nmの高分解能でのSBF-SEM観察を実現しています。


SBF-SEM 観察を行うことで、陰窩の実際の形態や幹細胞・パネート細胞などの空間的関係をより正確に把握でき、腸管の機能や病態の理解をより一層深めることが期待できます。

※資料ご提供:ヘルシンキ大学 Ilya Belevich 様
※スライス厚30nm、5120×3840ピクセル、450セクションの観察を行いました。
※HITACHI SU7000へKatana(ブロックフェースイメージングユニット)を搭載し、観察しました。

タバコの苗

タバコ(Nicotiana tabacum)の苗木は、植物の成長と環境への適応に関する重要な情報をもたらします。苗木の成長過程で細胞とその内部プロセスを理解することは、作物管理や遺伝子工学の進歩に大いに役立つ可能性があります。katanaブロックフェースイメージングユニットは、タバコの苗木の細胞壁と葉緑体の3D構造をビジュアル化するために使用されており、これらの構造を詳しく調べることで、植物の成長過程において細胞壁がどのように拡大するか、葉緑体の分布が苗の成長にどのように関与しているかを理解する手助けとなります。この研究を通じて、農業技術の向上が期待されます。

扁形動物 Macrostomum lignano

自由生活性の扁形動物である Macrostomum lignano は、生物学的研究における貴重なモデル生物です。その再生能力と透明な体により、幹細胞生物学、老化、有性生殖などの分野で興味深い主題となっています。したがって、その内部形態の詳細な知識は、その生物学的プロセスについての洞察を得る鍵となります。 katana は、M.lignanoの 3D 構造をナノメートルの解像度で取得することを可能にし、繊毛、ラブダイト、ウルトララブダイト、内部小胞などの一部の細胞構造の再構築を可能にします。重要な応用の 1 つは、M.lignanoの幹細胞の複雑なネットワークを視覚化することであり、これはその驚くべき再生能力を理解するために重要です。これは、生殖器官の独特な構造的特徴や、これらの器官と周囲の組織との相互作用を明らかにするのにも役立ちました。

象牙質細管閉塞

歯が敏感になると、象牙質細管が露出することが多くなり、不快感をもたらすことがあります。市販されている敏感用歯磨き粉は、象牙質細管閉塞として知られるプロセスを通じてこの問題を軽減することを目的としています。このプロセスの詳細な研究は、歯磨き粉の配合を最適化するために非常に重要です。ブロックフェースイメージングユニットKatanaを使用すると、ハイドロキシアパタイトや酢酸ストロンチウムなどのナノ粒子で構成される閉塞剤の象牙質細管への浸透を視覚化できます。これらの薬剤が細管とどのように相互作用するか、その沈着パターン、そして最終的に細管閉塞におけるそれらの有効性を明らかにします。治療前と治療後の画像を比較することで、さまざまな歯磨き粉製剤の閉塞効果を定量的に評価できます。

イカの皮

色素胞を利用したカモフラージュ

イカやその他の頭足類は、皮膚の色を変える驚くべき能力を備えた世界でも数少ない動物の1つで、周囲の環境に溶け込んで見つけるのが困難になります。皮膚の表面直下にある色素胞と呼ばれる何千もの特殊な色素含有細胞が、この驚くべき挙動の原因となっています。各発色団には、色素で満たされた弾性嚢が含まれています。嚢に付着した複雑な神経と筋肉の配列により嚢が拡張し、色素がより目立つようになり、皮膚の色が変化します。

ブロックフェースイメージングユニットKatanaを備えたSEM(SBF-SEM)により、発色団の高解像度3Dイメージングが可能になりナノスケールの超微細構造を視覚化し、細胞および細胞内レベルでの配列と接続性を調べることができます。

図 1. (a0 スライス厚 50nm の 600 枚の連続画像で構成されるイカ皮サンプルの概要体積データセット (743µm x 551µm x 30µm)。 (b) 高解像度のモンタージュ ROI から取得した色素袋の画像ピクセルサイズ 24nm (c) (b) で強調表示されたイカ皮サンプルのトリミング領域のボリュームレンダリング (d) (e) (c) に示す ROI から抽出された細胞弾性嚢の端のレンダリング すべての画像JEOL JSM-7800FLV SEM にインストールされた ブロックフェースイメージングユニットKatanaを使用して 5120 x 3840 で取得されました。

材料科学用シリアルブロックフェイスSEM

材料科学を次の次元に拡張する

ブロックフェースイメージングユニットKatanaは、連続ブロック面走査型電子顕微鏡 (SBF-SEM) の実行に使用されます。SBF-SEM は、生物学および医学研究における重要なツールとしての地位をすでに確立しており、これらの分野の進歩を推進しています。SBF-SEM は組織や生物の非常に詳細な 3D 画像を生成するためにライフ サイエンスで一般的に使用されていますが、材料科学や冶金学における SBF-SEM の応用は、これらのサンプルの切片作成に課題があるため、依然としてあまり研究されていません。

ここでは、材料科学における SBF-SEM 用のブロックフェースイメージングユニットKatanaの使用に成功し、バッテリーの正極材料とアルミニウムの両方の高解像度 3D 視覚化を実現した例を紹介します。Katanaミクロトームを使用した SBF-SEMを材料科学に拡張すると、金属の腐食挙動、腐食に対する有機コーティングの影響、塗料中の顔料の分布、金属間化合物粒子の分散などの分野でのさらなる理解を可能にする機会が得られます。

NMC電池材料(LiNiMnCoO₂)

リチウムイオン電池用リチウムニッケルマンガンコバルト酸化物正極

現在のリチウムイオン技術は、長寿命と、より優れた電力およびエネルギー貯蔵性能が求められますが、これを達成するには、各コンポーネントの構造と化学を包括的かつ詳細に理解する必要があります。

これらの材料にKatanaを使用すると、SEMはナノレベルの微細構造を観察できる高解像度の3D画像を取得できます。

たとえば、充電/放電サイクルの結果として生じる凝集体、微粒子、または粒子の亀裂の分布を調査することがきます。下図はKatanaを使用してNi-Mn-Co 正極材料サンプルのSBF-SEM観察した事例です。

図:(a) アルミニウム基板上の Ni-Co-Mn サンプルから撮影した単一スライス画像。材料全体にわたる大きな粒子の分布を示しています。

     (b) Ni-Co-Mn サンプルの3D SEM像。元のデータは 5120×3840 画像、306 シリアル スライス、12nm ピクセルで、JEOL IT700HR FEG SEM に取り付けられた katanaを使用して取得されました。

アルミニウム合金

航空宇宙、自動車、その他の機械製造

アルミニウムおよびその他の金属合金は、その機械的挙動、優れた鋳造性、高い強度重量比および耐食性により、航空宇宙、自動車、造船およびその他のさまざまな機械製造分野で重要な役割を果たし続けています。従来、ほとんどの構造研究は 2D SEM などの従来の方法で得られる 2 次元イメージングに依存していました。ただし、細孔、粒子、金属間化合物のサイズ、形状、接続性、分布を定量的に特性評価するには、垂直 (Z 軸) 方向のデータも必要です。一部の研究者は、いくつかの 2D 画像を使用して 3D 情報の定量的評価を試みていますが、上で説明したバッテリー材料と同様、このアプローチでは正確で代表的な空間微細構造が真に得られません。

Katanaを使用すると、ユーザーは3DボリュームSEM データを取得できるだけでなく、ボリューム全体にわたる高度な元素分析につながるEDX測定も同時に行うことができます。下図は、Katanaを使用してSBFSEMとEDXを同時に実行して得られたアルミニウム (AL6061) の体積データセットの例を示しており、サンプル全体にわたるさまざまな元素含有物が明らかになります。

サンプルボリューム全体にわたる介在物の分布を示す体積 EDX データセット。元のデータは Tescan S8000 SEM で取得されました。

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