生成したEVにタンパク質などのコンタミが存在する場合、EV に機能的評価をすることは不可能です。
同様に、バイオマーカーの開発(PurePath)や探索的なオミクス解析の場合、汚染物質の存在により
シグナルとノイズの比が低下し、バイオマーカーの検出が困難になる可能性があります。

細胞治療(PurePath)の場合にも汚染物質含んだEVを患者に投与すると予期せぬ副作用が生じる
可能性があるため、純度が不可欠です。

この記事では、qEV Gen2(第2世代)と Legacy(第1世代)でのEVの純度比較をしました。これらの比較には
最も一般的なカラムサイズである qEV Original を使用しましたが、結果はすべてのカラムサイズに当てはまります。

タンパク質の汚染が最も少ない qEV カラムは・・・

EV 分野では、タンパク質の汚染度を口語的に「純度」と呼びます。EV 濃度をタンパク質濃度で割ることによって計算される EV 純度は、タンパク質 1 μg あたりの EVの数を示します。
カラム精製物 (PCV; EV に富む分離物) 中の EV 濃度を決定するために、Exoid(ナノ粒子マルチアナライザー) を使用して EVとEVサイズ領域の粒子を測定し、分析の下限を60 nmに設定し以下の粒子はカットオフしました。このカットオフを使用して、可能な限り類似点を比較できるようにします。

下図により、35 nm と 70 nm シリーズ両方の qEV Gen 2カラムから分離された EV精製サンプルは、Legacyカラムで得られるものより大幅に純度が高くなります (図 1)。Legacyカラムと比較して、qEV Gen 2/ 35 nm カラムおよび qEV Gen 2/ 70 nm カラムからの EVフラクションは、それぞれ 2.9 倍および 2.3 倍高純粋です。

純度は、精製されたカラム生成物 (PCV) 内の Exoid 可変抵抗パルス センシング (TRPS) を使用して 60 nmより、大きな粒子の濃度を測定し、これをタンパク質アッセイで測定された PCV 内のタンパク質の濃度で割ることによって算出しました。
(A)35nmシリーズを使用して精製したPCVのEV純度 ( Legacyでは n = 11、qEV Gen 2 では n = 15)、(B) 70 nmシリーズを使用して精製した PCV の EV 純度 (Legacyでは n = 10、qEV Gen 2 では n = 15)、すべてのデータは、正規分布していました。

データは平均±標準誤差として表示されます。統計分析は t 検定(t-test)を使用しております。
*p < 0.05、** p < 0.01

リポタンパク質の汚染が最も少ない EV を分離しますか?  

リポタンパク質除去の効率を評価するために、最も一般的に分析される 2 つのリポタンパク質マーカー、ApoA1および ApoBに対して ELISA を実施しました。ApoA1は、最小タイプのリポタンパク質である高密度リポタンパク質 (HDL) のマーカーです。qEV Gen 2カラムからの EV 分離株中の ApoA1の量は、事前に分離された血漿サンプルから ApoA1の 0.005% 未満です。これは ApoA1の効果的な除去であるため、qEV Gen 2カラム分離株の HDL 汚染レベルが信じられないほど低いことが予想されます。HDL 粒子の直径は 15 nm 未満であり、35 nm も 70 nm カラムも PCV 内でそのサイズの粒子を回収することはまずありません。

ApoB に関しては、少し異なります。これは、ApoBが中間密度リポタンパク質 (IDL)、低密度リポタンパク質 (LDL)、および超低密度リポタンパク質 (VLDL) のマーカーであり、これらはすべてEVのサイズと重複するためです。そのため、HDL よりも EVと一緒に回収される可能性が高くなります。図 2 からわかるように、35 nm および 70 nm カラムの両方の qEV Gen 2では、EVフラクションにおいてApoBの枯渇、つまり IDL、LDL、および VLDL リポタンパク質の汚染を大幅に改善ししたことを示しています。ApoB レベルが最も低かったのは qEV Gen 2 / 70 nmカラムで、ApoB レベルは Gen 2 / 35 nmカラムよりも大幅に低くなりました (p<0.05)。

ApoBのレベルは、血漿サンプル、またはそのサンプルを qEV Legacy または、qEV Gen 2 / 70 nm カラムに通すことによって生成されたEVフラクション(PCV) において ELISA によって測定されました。
n = 6 で、3 つの列がそれぞれ 2 回使用されました。
データは正規分布し、統計分析は t検定(t-test)によって行われました。データは平均±標準誤差として表示されます。
*p < 0.05、** p < 0.01

qEV Gen 2 / 70 nm シリーズがもっとも純粋なEVを抽出可能

上記に示したすべてのデータをまとめると、明らかに qEV Gen 2 / 70 nmシリーズが最も純粋なEVを抽出できます。タンパク質汚染に関する純度はqEV Gen 2 / 35 nmシリーズと同等ですが、EV からリポタンパク質汚染を除去することができます。これらのテストでは、qEV Gen 2 / 70 nmシリーズはタンパク質の 99.4%、ApoA1 (HDL) の 99.9%、ApoB (IDL、LDL、および VLDL) の 99%を除去しました。純粋な EV が必要な場合、ここに示されているデータは、qEV Gen 2 / 70 nmシリーズが安全な選択肢であることを示しています。

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