MISEV2023に伴いqEV使用時に知っておくべきこと

著者／Kate Timms, PhD Senior Scientist (IZON)
翻訳／メイワフォーシス株式会社

qEVを用いた研究を発表するために、
MISEV2023の内容を把握する必要があります

国際細胞外小胞学会(ISEV)は、数年ごとに命名法から方法論の報告に至るまで、細胞外小胞 (EV)分野のあらゆるものについて大規模調査を実施します。その結果から、ポジションペーパー「細胞外小胞研究のための最低限の情報(MISEV)」が作成されました。2014年の初版¹に続いて2018年に更新版²、 2024年初頭に、最新版 MISEV2023^３として発行されました 。

MISEVの推奨事項は発行を重ね、細胞外小胞の研究が発展するにつれて変化してきました。新規および既存の研究者・査読者・編集者・製品開発者に、再現性・透明性を促進することを目的としています。

このページでは、MISEV2023を要約し提案を述べるとともに、qEV（細胞外小胞抽出キット）がMISEV2023を満たすために知っておくべき重要な点をご紹介しています。

命名法に関する一般的な推奨事項

MISEV2023は「エクソソーム」などの根拠のない用語の使用を防ぐことにより、EVの種類について論じた記事に概ね同意しています。

ただし、いくつかの新しい用語が推奨されます。例えば、「細胞外粒子（EP）」は、「ナノメートルからミクロンのサイズ範囲の細胞由来の多分子集合体」を表す包括的な用語として推奨されています。これにはEVだけでなく、MISEVが「非小胞性細胞外粒子（NVEP）」と呼ぶ大量の非EV粒子も含まれます。

「EV」と「NVEP」が共存する場合、MISEV2023では「EP」を提案していますが、基本的には「NVEP」を100%除去できるEV分離プロセスはありません。このため、分離後のEV濃縮サンプルを単に「EV」と呼ぶのではなく、「EV isolate」という単語を使用します。

サンプル処理に関する一般的な推奨事項

MISEV2023はサンプル処理に関する一般的な推奨事項にも言及しています。
一般的に血清よりも血漿の使用を推奨するのは、サンプル処理中のEVおよびEPの生成を防ぐため、細胞/血小板/組織をできるだけ早く除去するためです。MISEV2023を満たすには、細胞、NVEP、遊離タンパク質から分離後の汚染レベルを、EV分離株純度の指標として明記する必要があります。

MISEV2023では、機能研究またはバイオマーカー研究のために、生のサンプルとEV除去サンプルを EV分離株と並行して分析することも推奨しています。

MISEV2023におけるSECの位置付けに関する簡単な注意事項

MISEV2023では、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を密度勾配精製よりも特異性が低く（isolate の純度が低い）、超遠心分離と特異性が類似していると位置付けています。これは、文献にある3つのテクニックを比較したデータとは一致しません。^4、5

EV分離技術の相対的な特異性／純度については、よりバランスの取れた適切な評価を得るために、選択したサンプルタイプを使用して、複数の比較データを探すことを推奨します。 

サイズ排除クロマトグラフィーに関する推奨事項

qEVユーザーに最も関連するもの、つまりSECの方法論の報告に関するMISEV2023について、説明します。それぞれの推奨事項を順番に取り上げ、それらを満たすためにできることを説明します。

1. マトリックスの種類とポアサイズ：
　マトリックスを含むカラムの高さと直径（または体積）

qEVには、20、35、70 nmの３つのカラムシリーズがあり、独自の方法で架橋された、アガロース樹脂が使用されています。カラムの寸法は以下の表を参照ください。

２．カラムの充填方法（または市販カラムの供給元）について

qEVカラムシリーズ（例: qEVoriginal） とポアサイズ（例: 20 nm）を明記する必要があります。35nmおよび70nmシリーズカラムは、qEVレガシー（第一世代／現在は製造中止）または、qEV Gen 2（第2世代）かどうかも記載することをお勧めします。

執筆時点では、qEVシリーズまたはポアサイズをEV-TRACKに入力することはできません。これは、この分野の厳密性、再現性、透明性を防ぐためには非常に残念なことです。2023年3月にEV-TRACKの主催者にこの問題を提起しましたが、返答はありませんでした。qEVユーザーの皆様には、EV-TRACKにqEVカラムタイプを記載するスペースを含めるよう、リクエストすることを推奨します。

３．従来の分離/濃縮ステップを含む、SEC前サンプルのソース、
　　体積、粒子濃度の明記について

サンプルのソース（関連する生体認証データとサンプリング技術を含む）、量、および SEC前の手順を詳述するだけです。さらに、サンプル量は qEV カラムに1回で追加したのか、2段階以上のステップで追加したのかを詳しく説明することをお勧めします。

SEC処理前のサンプル濃度を記載する際には注意が必要です。多くの場合、SEC前のサンプルは非常に汚れているため濃度の測定が困難です。様々な種類の粒子で構成され複雑な生体流体で、非常に大きな粒子と高レベルのタンパク質が存在しています。そのため、正確な濃度測定が妨げられます。また、粒子濃度を測定する際に、EV を他の粒子から区別することもできません。これは、理論上の EV の損失が、実際には汚染リポタンパク質の損失である可能性があることを意味します。EV用の信頼できる万能マーカーもありません。

SEC（および他のEV分離技術）は、サイズ、密度、電荷などの物理的特性に応じて、EVを異なる量で分離する可能性があります。したがって、EVマーカーを使用する際には、隔離前後の EV 濃度の変化を正確に反映していない可能性があります。現時点ではEVマーカーを正確に使用することは不可能だとおもわれるため、これについての良い提案はありません。

4．バッファーの記載について

SECによるEVの分離と保管のためのバッファー組成を記載することは、EVの数、サイズ、安定性に影響を与える可能性があるため重要です。^６

5. 重力または圧力の明記について

qEVカラムを手動で使用する場合、またはオートフラクションコレクター（AFC）を使用する場合は、重力によって分離することになります。手動での分離と比較してAFCを使用すると再現性が向上するため、どの分離方法を使用されたかを記載することをお勧めします。または、大型の既製カラム、またはカスタマイズされた非常に大型のカラム (2L 以上のサンプル) を使用している場合は、ポンプベースのクロマトグラフィーユニットを使用している可能性があります。これらの装置で使用されるパラメーターは明記する必要があります。
大型クロマトグラフィーユニットについては、今後発売予定となります。詳細はお問合せください。

６．ボイド容積と収集されたフラクションの数と体積について

ボイド容積(バッファー容積とも呼ばれます)、フラクション容積、およびフラクション数は、カラムサイズと樹脂シリーズにあわせ、qEVユーザーマニュアルで推奨されているものと同じかもしれませんが、念のために明記してください。
EVが濃縮された収集画分を精製収集体積（PCV）と呼ぶことに注意してください。

7. SEC後の濃縮方法について

あらゆる前処理と同様に、SEC後の処理も分離物の組成に影響を与えるかもしれないので記載が必要です。方法、濃縮倍率、濃縮前分離物との比較を明記します。

8. カラム再利用の有無、カラムの再生方法、カラムの使用回数について

qEVカラムの洗浄方法はサンプルのキャリーオーバーを最小限に抑えます。使用回数がユーザーマニュアルに記載されている回数より多い場合は、特に使用回数を記載することが重要です。

MISEV2023ガイドライン

MISEV2023ガイドラインは法律ではありませんが、研究コンセンサスを表し、理想となるものです。ガイドラインを完全に満たせない場合でも、研究の公表を控えるべきではありませんが、新しいプロジェクトを計画する際には念頭に置くことが適切です。一般的には、研究の質やEVコミュニティからの受け止められ方も向上するはずです。

MISEV2023ガイドラインは歴史の一時点であるため、すぐに時代にそぐわなくなります。 新しい技術革新や発見がEV分野を変えていきます。MISEV2023にその方法が言及されていないからといって、自ら試みる価値がないわけではありません。今後、私たちにはいくつかの新しい計画がありますので、是非ご注目ください。

参考文献

1. Lötvall, J. et al.
   Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.
   J Extracell Vesicles 3, 26913 (2014).
2. Thery, C. et al.
   Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.
   Journal of Extracellular Vesicles 7 (2018). https://doi.org/10.1080/20013078.2018.1535750
3. Welsh, J. A. et al.
   Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.
   J Extracell Vesicles 13, e12404 (2024). https://doi.org/10.1002/jev2.12404
4. Veerman, R. E. et al.
   Molecular evaluation of five different isolation methods for extracellular vesicles reveals different clinical applicability and subcellular origin.
   Journal of Extracellular Vesicles 10 (2021). https://doi.org/10.1002/jev2.12128
5. Brennan, K. et al.
   A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum.
   Scientific Reports 10 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-57497-7
6. Gorgens, A. et al.
   Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.
   Journal of Extracellular Vesicles 11 (2022). https://doi.org/10.1002/jev2.12238

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