このステップガイドでは、主にqEVを使用する場合、EVマーカーおよびその他のEV関連タンパク質を扱うウェスタンブロッティング法のプロセスと失敗しないための注意点について説明します。

ウエスタンブロッティングは広く普及している実験手法ですが、失敗しやすいポイントが多く存在し、十分に信頼できる結果を出すためには時間が必要です。またウェスタンブロッティングのプロトコルは、使用している機器、サンプル、抗体、その他の多くの要因に基づいて大きく異なります。

【STEP 1】　サンプルの溶解とバッファー

液体サンプル (qEV カラムからの精製コレクションボリューム /PCV） など から始める場合、EVサンプル の溶解に使用するバッファーから注意する必要があります。

1x RIPA バッファー (Radioimmunoprecipitation Buffer)と呼ばれる一般的なバッファーがありますが、これを使用するだけでは優良な結果を得ることは困難です。私たちの経験では、RIPAは優秀なバッファーではありますが、最良の結果を得るためには、少し条件調整が必要な場合があります。

最も簡易な溶解方法は、フラクションまたはPCVを濃縮RIPAの希釈液として扱い、サンプル中の最終濃度を1x RIPAにすることです。

例えば

10x RIPA 溶液があり、最終濃度 1x RIPA でサンプルあたり最終容量 200 μL が必要な場合、これは 20 μL の 10x RIPA バッファーを取り、それに 180 μL の画分または PCV を追加することを意味します。  

EV のペレット (例: qEV 細胞外小胞抽出キット) がある場合は、1x RIPA に再懸濁するだけで目的のサンプル量に達します。どのような方法で溶解しても、プロテアーゼ阻害剤を必ず追加してください。リン酸化を研究したい場合は、ホスファターゼ阻害剤も必要です。

ヒントとコツ

EV は細胞よりも溶解しにくい場合があります。RIPA を使用予定濃度よりも高い濃度 (1倍以上) で使用すると、溶解がより激しくなる可能性があります。最終濃度が5x RIPA を超えると溶解が改善されますが、目的のタンパク質に影響を与える可能性があります。
したがって、事前に用意しやすいサンプルでさまざまな RIPA 濃度を試し、測定したいタンパク質にとって最適な濃度を確認しておくことが推奨されます。

RIPA やその他の溶解バッファーを使用せずに良好な結果が得られる場合もあります。その場合はEV全体を変性させるだけで、一部のタンパク質に対して良好なシグナルを取得しているようです。これがアプリケーションでどのように機能するかを自分の手でテストして確認することをお勧めします。

【ステップ 2】サンプル使用量

理想的には、溶解する前に最適なサンプル量を知る必要があります。ただし、溶解サンプルに含まれるタンパク質の量がわからないと、使用するサンプルの量を決めるのが難しいために最適なサンプル量がわからない場合があります。
この解決方法はは、ウェルごとに特定量のタンパク質をロードする場合にのみ当てはまりますが、代わりに、各ウェルに等量のサンプルをロードして、フラクションやPCVとタンパク質の多い後のフラクションを比較することでも可能です。

ヒントとコツ

初期EV レベルが低いことが原因で、サンプルが十分に濃縮されていない可能性があります。この場合は、qEV濃縮キットを試し、ウェスタンブロットを実行するのに適した量の RIPA に再懸濁してください。

PCV には個々のqEVフラクションよりも多くのEV含まれているため、フラクションでタンパク質を確認するのが難しい場合は濃縮 PCV を試してみるのが良いです。

それでも個々のフラクションを評価する必要があり、ウェスタンブロットでタンパク質を測定するのに十分な濃度のEVが得られない場合、qEV分離の前に元のサンプル量を増やすことをお勧めします。この場合、より大きなqEVカラムに変更する必要があるかもしれません。しかし、個々のフラクションに含まれる一般的なEVマーカーは、一般的に500 µLの血漿からでも確認されているため、バイオフルイドではサンプル量が問題になる可能性は低いです。‍

【STEP 3】サンプルを還元するかどうか

溶解したサンプルを用意し、ウェルごとにロードする量を決定したので、サンプル バッファーを追加します。これにより、サンプルがウェルから上向きに流れ出ないだけの十分な重さが得られます。

さらに、還元剤を添加することでサンプル中のタンパク質を還元するために使用することもできます。還元剤はジスルフィド結合を切断するのに役立ち、タンパク質の変性を助けます。

このステップでは、タンパク質を変性させ、タンパク質がゲル内をより自由に移動できるようにするために、サンプルとサンプル緩衝液混合物も加熱する必要があります。

例えば

β-メルカプトエタノールを還元剤として使用できます。私たちの経験では、サンプルに追加する必要がある量を減らすためにサンプルバッファーを 5 倍の濃度で作成することが多く、これによって不必要な希釈を減らします。加熱の場合は、通常、95 ^℃で 5 分間で十分です。煮沸して還元した/還元しなかった場合、サンプルをゲルにロードする準備が整います。

ヒントとコツ

タンパク質を還元するか確認が必要です。一部の抗体はタンパク質の非還元型のみを検出しますが、他の抗体は還元型のみを検出します。これは個々の実験系で試してみる必要があります。一般に、サイトゾルタンパク質は還元条件を必要とする場合がありますが、テトラスパニンのような膜貫通タンパク質は必要ありません。

ただし、これは厳密なルールではありません。タンパク質/抗体のペアリングに還元条件と非還元条件のどちらが必要かが不明な場合は、還元条件と非還元条件の両方を用意したサンプルでテストブロットを行うことが最善です。

【STEP 4】ゲルから膜に転写

この部分は、目的のタンパク質のサイズとウェスタンブロットの設定に大きく依存するため、ここでアドバイスできることはほとんどありません。

ヒントとコツ

個別の分画を分析している場合は、各サンプルに対して等量のタンパク質を分析しているのか、それとも等しい質量のタンパク質を分析しているのかを決定する必要があります。タンパク質濃度が非常に低い一部のフラクションでは、等しい質量のタンパク質を分析することが非常に困難になります。

ゲルに追加できるコントロールがいくつかあります。1 つ目は生のpre-columnサンプルです。これにより、開始サンプルに目的のタンパク質が存在するかどうかがわかります。  

目的のタンパク質がどこに存在するかを知ることも重要です。個々のフラクションを調べていない場合は、バッファーボリューム、PCV および PCV 後のサンプルを実行して、目的のタンパク質が遊離タンパク質と結合していないことなどを確認することで行うことができます。

ステップ 5: 確認（ここまでの工程でうまくいかなかった場合は…）

個々のタンパク質を探す前にできることとして、可逆性膜染色を使用して、ブロットにタンパク質が存在することを確認することができます。

例えば

可逆的な膜染色としてポンソー S染色液を使用できます。これをメンブレン上に注ぎ、表面上で撹拌してから洗い流すだけで、ブロットメンブレンの各ウェルのタンパク質のバンドが確認できます。最終的には汚れがすべて洗い流され、汚れは染色前と同じようにきれいな状態になります。

ヒントとコツ

等しい体積で個々のフラクションを実行している場合、より弱い/より強いバンドや、異なるフラクションに異なるバンドが表示されるのは正常です。  

個々のタンパク質バンド（抗体で検出されたもの）や全タンパク質染色（可逆性膜染色）でタンパク質がゲルの最上部にしかない場合、溶解が非効率的でEV全体がゲルへのタンパク質移動を妨げている可能性があります。この場合、ステップ1で提案したように、RIPA濃度を上げるとよいでしょう。また、プレキャストゲルを使用する場合は、電流が適切に流れるのを妨げているゲルの底にある包装ストリップを必ず取り除いてください。

【ステップ 6】抗体の検出

ブロッキング後、目的のタンパク質に特異的な抗体でメンブレンをプローブし、続いて適切な二次抗体を使用します。これは抗体メーカーのプロトコールに従って行う必要がありますが、最良のシグナルを得るには手で微調整する必要がある場合があります。

ヒントとコツ

ポジティブコントロールとして、目的のタンパク質の組換えバージョンをゲル上で実行できます。このコントロールはグリコシル化などの修飾が欠如している可能性が高いため、より小さい可能性があります。

サンプル中にタンパク質が検出されない場合は、サンプルを濃縮して再試行してください。それでも検出されない場合は、EV中のマーカーが検出可能な濃度を下回っているか、そのマーカーが含まれていない可能性があります。

サンプル中にタンパク質が検出されない場合は、サンプルを濃縮して再試行してください。それでも検出されない場合は、EV中のマーカーが検出可能な濃度を下回っているか、そのマーカーが含まれていない可能性があります。

クリアなバンドではなく CD63 の汚れが見られる場合でも、これは正常な現象なので心配する必要はありません。CD63 は高度にグリコシル化されており、このタンパク質にはさまざまなサイズとさまざまな量の糖部分が存在することを意味します。CD63 の検出に問題がある場合は、より明確なバンドが得られる傾向のある CD9 や CD81 などの別のテトラスパニンを試すことをお勧めします。

【ステップ 7】結果の解析

結果を解釈するのは簡単かもしれませんが、結果が予想していたものと異なる場合は、さらに面倒になる可能性があります。科学的な解釈を行う前に、新しいサンプルを使用してブロットを再度実行し、同じ結果が再度確認されることを確認することが最善です。  

ヒントとコツ

qEV Gen 2 カラムを使用して EV を分離したときに、レガシー カラムで行ったときと同じタンパク質が見つからない場合は、考えられる原因は二つあります。一つは古いプロトコルを使用している可能性（新しい樹脂に合わせて容量を一部変更しました）と、もう一つは目的のタンパク質が EV に関連しておらず、より新しい純粋なカラムによってこのタンパク質が EV 分離株から除去されている可能性があります。

レガシーカラムは可溶性タンパク質を 97% 以上除去しましたが、Gen 2 カラムは可溶性タンパク質を約 99% 除去しました。これは小さな違いのように思えますが、EVフラクションまたは PCV に可溶性タンパク質が見られるかどうかの違いを生む可能性があります。この場合、Gen 2 カラムの結果は純度が向上するためより正確になります。タンパク質が多く含まれるフラクションをチェックして、代わりにタンパク質がそこに存在するかどうかを確認してください。

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