評価事例
転移性乳がんに対するEVタンパク質およびDNAマーカーの診断可能性比較
qEVカラムを使用して、実際に細胞外小胞に関連するカーゴを特定し、乳がんにおけるそのバイオマーカーの可能性を評価( Tkach et al. 2022 )研究の概要です。
循環EVは、多くの疾患、特に腫瘍学の分野におけるバイオマーカーとして関心を集めています。研究では、EV 関連分子が有望な結果をもたらし、その多くが少なくとも循環腫瘍細胞の予後能力に匹敵する予後可能性を示していることが報告されました。その後、バイオマーカー研究スペースではEV miRNA、mRNA、または表面タンパク質に基づく研究が盛んに行われています。一方、DNA ベースのマーカーの最良の供給源はまだ議論中です。
EV はバイオマーカーの可能性を備えた DNA の優れた供給源となりえるのか
Tkach氏らによる研究では、PNAS (2022) に掲載された論文で、著者らは、EV 関連 DNA と転移性ホルモン依存性乳がんの診断におけるその有用性を探求することで、この問題に取り組みました。
この研究では、健康なドナーとER+(エストロゲン受容体陽性)およびHER2-(ヒト上皮成長因子受容体2陰性)両方の転移性乳がんを患う女性から血液サンフラクションが採取されました。サンフラクションは次のように処理および分析されました。
- 血液はEDTAチューブで採取されました。血漿は 4 時間以内に分離され、使用するまで -80°C で保存されました。
- 血漿を遠心分離し、qEV Original / 70 nm カラムにロードしました。収集された qEVフラクションは、EV 濃度に従って分けられ、研究では EV が豊富なフラクション、EV が中間のフラクションおよび EV が少ないフラクションとして分類されました。
- 個々のフラクションは、粒子数と EV/非 EV マーカーによって特徴付けられました。3 つの qEVフラクションおよび未処理血漿において、EV DNA および EV 表面タンパク質が評価され、バイオマーカー値が比較されました。ここでは、DNA が抽出され、次のように定量化されました。
- 総無細胞 DNA
- qPCR 増幅可能な細胞 DNA (cellDNA)
- ddPCR 増幅可能な循環腫瘍 DNA (ctDNA)
- qPCR 増幅可能なミトコンドリア DNA (mtDNA)
さらに、EV タンパク質に基づく分析は、フローサイトメトリー蛍光ビーズ/抗体多重アッセイを介して 37 の EV 表面タンパク質の分布を評価することによって実行されました。
転移性ホルモン依存性乳がんの診断に可能性を示すのはDNAではなくEVタンパク質
この研究の結果から、EVが豊富なフラクションは、未処理の血漿、EV中間、およびEVが少ないフラクションと比較して、正常な生理機能に関連する総無細胞DNAの量が少ないことが明らかになりました。さらに、EVが豊富なフラクションにおいて、健康な患者のものと乳がん患者のものを比べた際、総無細胞DNAの差は検出されませんでした。これらの結果は、細胞 DNA の定量化によってさらに確認され、健康な人の EV が豊富なフラクションからは細胞 DNA が枯渇しているか、癌患者の他の EV フラクションや血漿と比較して EV が豊富なフラクションでは細胞 DNA が著しく少ないことが示されました。
がん関連生理学では、ctDNA の既知の腫瘍変異は、個々の qEV 由来の EV フラクションまたはすべてのフラクションの合計よりも未処理の血漿中に豊富に存在しており、血漿画分の分離により一部の ctDNA が失われることが示唆されています (図 1)。一方、治療抵抗性と関連しているEVのmtDNAは、健康な人ではEVが豊富なフラクションと未処理の血漿でより多く検出されましたが、がん患者では未処理の血漿でのみ濃縮されました。これは、循環mtDNAが健康な血漿中のEVから回収される可能性が高いですが、乳がん患者からは回収されないことを示しています。したがって、tDNA分析による血漿EVの分離は疾患モニタリングを改善しませんでした。
もう1つの重要な発見は、膜に露出したEVタンパク質の評価に関連しており、乳がん患者のEVでは健康なドナーと比較して4つのタンパク質が有意に濃縮されていました。がん陽性を判定するための 3 つ以上の濃縮マーカーの基準に基づいて、フローサイトメトリーを用いてこれら 4 つの濃縮タンパク質 (CD326、CD146、CD105、および CD14) の分布を分析するパイプラインでサンフラクションを分類しました。このアプローチは、サンフラクションサイズ 9 で感度 78%、特異度 100% を達成しました。
循環小型EVに関連するDNAは乳がんに関して臨床的に有用な情報とはみなされず
単離された小型EVのDNAマーカーの分析では、乳がんの有用な予後または診断情報は得られず、DNAマーカーは未処理の血漿でより効果的に検出されました。しかし、これらの結果は、大型EVがバイオマーカーDNAを保有している可能性や、RNAなどの他の核酸がこの特定のがんの診断に価値がある可能性を排除するものではありません。それにもかかわらず、4 つの EV 表面関連タンパク質は有望なバイオマーカーの可能性を示しました。信頼性の高い EV 単離を伴う場合、市販キットによるこれらのタンパク質の検出は日常的な臨床診療に適用できる可能性があります。
qEV カラムは EV バイオマーカーの発見を強化できます
EVの異なるサブタイプは、バイオマーカー価値を持つ分子を異なる形で運搬・発現しますが、EVと共分離しバイオマーカーカーゴと会合する非EV成分も存在し得ます。そのため、研究上の課題として、目的のEVを正確に分離することや、疾患や病期に関連するEV分子の特徴的な発現を特定すること、未処理の血漿など入手が容易な他のサンプルと比較して、感度や特異性の観点からEVバイオマーカー価値を評価することが残っています。
EVバイオマーカーの発見から臨床応用までの道のりは長いですが、EV分離のための適切なツールで研究を始めることは、技術的なハードルを克服するために大いに役立ちます。研究者は、目的のEVを分離し、その純度を確保するための信頼できる方法を特定する必要があります。そうすることで、研究結果の正確性と信頼性を高めることができ、最終的にはEV バイオマーカーの臨床実践への導入に成功しました。