VRef アプリケーション

サイズと濃度の測定 (VRef)

EVはサイズ分布が広いため、ほとんどの分析方法ではサイズの評価が困難になる可能性があります。長時間の測定を行う前に、VRef-63GFP(リファレンスEV CD63-GFP)のアリコートを用いて測定し、結果を確認してください。サイズ分布が切り捨てられている／公称範囲内にない場合、または粒子濃度が過剰／不足している場合は、取得パラメータを調整が必要です。

蛍光標識による表現型解析 (VRef)

蛍光検出の感度を評価することは非常に重要です。シグナルの過少または過剰表現は測定の失敗につながる可能性があります。
VRef-63GFP（リファレンスEV CD63-GFP） の強力な GFP シグナルにより、蛍光検出の感度を制御できます。

抗体をそのまま使えるポジティブEVプラットフォーム(VFc-mNG)

VFc-mNGは、抗体の Fc領域と結合できる特殊なEV（細胞外小胞） を用いた、機能解析・抗体結合評価・ナノ粒子研究のための次世代エンジニアードEVです。
CD63を介した mNeonGreen（mNG）蛍光シグナル を内包しており、単一EV解析や取り込み実験の ポジティブコントロール としても利用できます。

生産細胞は、EV表面に Fcドメイン特異的結合モジュール（Fc-binding domain） を提示するように遺伝子導入されます。
これにより、細胞から放出されるEV（Fc‑EVs）は、表面に Fc領域を持つ任意の抗体（mAb）をそのまま結合できる構造を獲得できます。
得られたFc‑EVsは、研究目的に応じて 治療用カーゴ（薬剤・核酸・タンパク質など）を内包させることができ、さらに結合させた抗体の特異性に基づき、がん細胞を含む多様な標的組織へ選択的に送達できます。

抗体結合の特異性（EV特性/蛍光およびFc結合機能の評価）

VFc‑mNG は、Fc領域を持つ抗体に特異的に結合するEVであり、フローサイトメトリー解析によりその特異性と蛍光特性を確認することが可能です。
以下の図では、VFc‑mNG と、VRef 63mNGについて、 hIgG1‑APC 抗体とCD63-APC抗体に反応させた結果を示します。

VFc‑mNG は hIgG1‑APC 抗体とCD63-ACP抗体と明確に結合

VFc-mNGはhIgG1-APC抗体とCD63-APC抗体に結合しますが、VRef-63mNGは、CD63-APC抗体とのみ結合します。このことから、Fc領域に対する結合が VFc‑mNG に特異的であること並びに、VFc‑mNGはCD63エピトープを保持しており、EV本来の構造を損なわずにFc結合機能を付加できることが明らかになりました。

Fc結合EVは、抗体を混ぜるだけで任意の標的に向かうカスタマイズ可能なEVを簡単に作れるため、ターゲティング研究・薬剤送達・抗体評価に非常に有用となります。

活用事例

柔軟な EV 共局在実験

未知の EV サンプルの共局在は、準備と免疫標識のステップの難しさを考えると、実行が困難な場合があります。VFc-mNG(Fc結合EV-mNG)は、FITC チャネル (励起 488 nm、発光 525 nm) で蛍光を発する細胞外小胞の蛍光源を提供するほか、一次結合 Fc 抗体による機能化による第 2 の色も提供します。

フローサイトメトリー測定の標準化のための信頼性

ナノフローサイトメトリーは、CD9、CD63、CD81 といったテトラスパニンを指標に細胞外小胞（EV）を検出・定量するための主要な手法として広く利用されています。しかし、EVは非常に小さく光学的な散乱シグナルも弱いため、装置がどこまで小さな粒子を正確に検出できるかを評価することは常に課題でした。
こうした背景の中で、実際のEVを基盤とし、複数チャネルで明瞭な蛍光シグナルを示す VFc‑mNGは、EVの光学特性を保ちながら抗体結合の評価にも使用できる新しいリファレンス素材として機能します。この素材を用いることで、EVへの抗体結合の解析が容易になるだけでなく、フローサイトメトリーでの感度確認や測定条件の微調整がより正確に行えるようになり、EV解析の再現性と精度を大きく高めることができます。

連続した安定試験への活用

一般的なEVは冷蔵から室温への温度変化や凍結融解の処理によって分解することが知られており、これらの処理によって分析や一連のプロジェクトにおけるデータ取得に支障をきたすことがあります。
VFc-mNGはVSafe(EV保存用バッファー)で安定化されているため、－80°C ～－20°C で長期間安全に保管でき、インキュベーションや分析中の動作温度でも目立った劣化なく保管することができます