アプリケーション
未結合の色素と抗体の除去①
VSEC-35(遠心分離SECカラム) アプリケーション
英国バーミンガムのアストン大学アンドリュー・デビット教授の研究室では、アポトーシス細胞由来細胞外小胞 (ACdEV) の放出による細胞死と免疫系へのシグナル伝達を研究しています。特に、ACdEV が自然免疫細胞を調節する分子メカニズムに興味を持っており、マクロファージの炎症状態に対する ACdEV 表面プロテオームの寄与に焦点を当てています。
BODIPY™ FL マレイミド標識 ACdEV のバックグラウンドノイズの低減において、
qEV original と同等の効率を示しています。
A) qEVの分離システム SEC(EVのサイズ排除クロマトグラフィー)を繰り返して同時に ACdEV を分離し、染料/抗体をクリーンアップすると時間がかかり、大量のサンプルが必要になります。
B) qEVの分離システム SEC (EVのサイズ排除クロマトグラフィー)による ACdEV 分離に続いて、 VSEC-35(遠心分離SECカラム) による未結合色素/抗体のクリーンアップにより、ワークフローの効率が向上します。
C) 代表的なフロープロットと FITC イベントバーストトレース。
過剰な BODIPY™ FL マレイミド色素によって引き起こされる FITC チャネルのバックグラウンド ノイズが約 4 倍減少したことからもわかるように、VSEC-35(遠心分離SECカラム) は過剰な未結合蛍光体を除去する点で qEV original と同等の効率性があることがわかります。
濃度が希釈される qEV original とは異なり、サンプルの濃度と容量を維持します (表1)。さらに、VSEC-35(遠心分離SECカラム) 1 個あたりの必要なサンプル容量は最小限 (50 ～ 100 μL) であるため、必要な色素/抗体の量を減らすことができます。
VSEC-35(遠心分離SECカラム)を染料/抗体インキュベーションワークフローに組み込むことで、ACdEV の短時間・高スループット処理が可能になり、各 ACdEV サンプルから得られる情報が最大化されます。
| サンプルの準備 | ACdEVの濃度 （BODIPY™+粒子/mL） | クリーンアップ手順前の ボリューム | クリーンアップ手順後に 収集されたボリューム |
|---|---|---|---|
| クリーンアップなし | 1.94E+10 | 該当なし | 該当なし |
| VSEC-35 (遠心分離SECカラム) | 2.46E+10 | 100μL | 100μL |
| qEV original | 6.58E+9 | 500μL | 100μL |
VSEC-35(遠心分離SECカラム)と qEV originalによるサンプルのクリーンアップにより、
以前は隠れていた集団が明らかになり、
BODIPY™+ 粒子/mL の濃度がより高くなったと報告されています。
濃度はフローナノアナライザー (NanoFCM) で測定しました (N = 1)。
未結合の色素と抗体の除去②
VSEC-35(遠心分離SECカラム) アプリケーション
蛍光標識 CD63 抗体を EV の特異的タグ付けに使用することの有効性を示しています。VSEC-35(遠心分離SECカラム) カラムを使用することで、余分な抗体と親油性色素で染色された EV を効率的に除去でき、その後のナノフローサイトメトリー分析の明瞭性と信頼性が大幅に向上します (図 1 、 2)。
分画遠心分離と接線流濾過の組み合わせを使用して腹水から EV を分離し、続いて Sepharose CL-2B 10mL カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを行いました。
約 5 × 10 8個の粒子を APC 標識 CD63 抗体 (クローン H5C6、Biolegend) とともに、4 °C で一晩、一定速度で撹拌しながらインキュベートしました。EV は VSEC-35(遠心分離SECカラム)で処理する前 (pre) と処理した後 (post) の両方でナノフローサイトメトリーで分析しました。二変量ドットプロットは、蛍光強度 (APC) と側方散乱 (SSC) の関係を示しており、処理後のシグナル増幅を強調しています。
分画遠心分離とタンジェンシャルフロー濾過の組み合わせを使用して腹水から EV を分離し、続いて Sepharose CL-2B 10mL カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを行いました。約 5 × 10 8個の粒子を蛍光標識親油性色素クローン (CellMask™ Deep Red、Thermo Fisher Scientific) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。EV は、VSEC-35(遠心分離SECカラム)で処理する前 (pre) と処理した後 (post) の両方でナノフローサイトメトリーで分析しました。二変量ドットプロットは、蛍光強度 (APC) と側方散乱 (SSC) の関係を示しており、処理後のシグナル増幅を強調しています。
